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第115期層析分離,是否一定要評價柱效?

2019年01月23日來源:管理員
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? ? ?有人問到:“我的工藝是流穿模式,是否需要評價柱效?”還有人問到:“我的工藝是親和層析,單梯度洗脫,不用擔心拖尾,是否需要評價柱效?”今天,小編為大家進行統一解答。

什么是柱效?

? ? ?柱效(column efficiency),是指層析柱保留某一物質而不使其擴散的能力。柱效越高,則分離度越高。

塔板理論及柱效評價標準

? ? ? 馬丁(Martin)和欣革(Synge)最早提出塔板理論,將層析柱比作蒸餾塔,把一根層析柱設想成由許多小段組成。在每一小段內,一部分空間為固定相占據,另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入層析柱后,就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內組分可以很快地在兩相中達到分配平衡,這樣一個小段稱作一個理論塔板(theoretical plate)。經過多次分配平衡,分配系數小的組分先離開蒸餾塔,分配系數大的組分后離開蒸餾塔。

理論塔板數(N)計算公式:


? ? ? 該公式中的Ve,必須從進樣時起算。

? ? ??每米理論塔板數(N/m)=理論塔板數(N) ÷ 柱床高度。

? ? ? HETP(height equivalent of theoretical plate),理論塔板等量高度,即每一層理論塔板的高度。

? ? ? 簡單來說,每米理論塔板數,是指每米有多少層;HETP,是指每一層有多高。可以說兩者是互為倒數的關系。

? ? ?評價標準:一般情況下,認為HETP <4倍粒徑大小即為比較理想的柱效。比如裝填平均粒徑90 μm的Sepharose填料,則要求HETP <360 μm,通過計算,要求每米理論塔板數 >2778。或可根據實際情況,將柱效標準定為每米理論塔板數 ≥3000。

對稱性,也稱峰不對稱因子(Asymmetry, As),用來評價層析柱裝填的均勻程度。


? ? ??As?=b/a。As >1,說明裝填偏松,表現為峰拖尾;As <1,說明裝填偏緊,表現為峰前沿。若對分離度有較高要求,可把標準定為0.8 <As <1.2;若對分離度要求并不高,可把標準定為0.8 <As <1.5,甚至更寬的范圍。

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是否一定要評價柱效?

? ? ? 總體來說,還是建議進行柱效評價的,但柱效評價標準不能一概而論。

? ? ??高標準:1)分子篩層析;2)反相層析;3)疏水層析;4)采用階性梯度或線性梯度洗脫的離子交換層析。此類層析對分離度有較高要求,有些需要采用多梯度洗脫或線性洗脫,如果柱效不佳,往往會造成峰擴散或拖尾,會對純化效果產生很大影響。建議標準:HETP <4倍粒徑,0.8 <As <1.2。

? ? ? 低標準:1)親和層析;2)采用單梯度洗脫的離子交換層析。此類層析僅需采用單梯度洗脫,有時在產物洗脫下來后,還要立即進行稀釋,以防產物聚集,因此對分離度要求較低。然而,過于嚴重的峰擴散和拖尾,也是會影響純化效率的,因此柱效測定也必不可少。建議標準:HETP <5倍粒徑,0.8 <As <1.5。

? ? ? 僅要求峰型及對稱性:流穿模式。此類模式為目標產物流穿,雜質被吸附,如果填料裝填不均勻,或者過于松散,仍會導致吸附不勻而影響載量和處理量。因此,評估柱效時建議觀察一下峰型及對稱性,如果峰型平滑,且對稱性良好,即可接受。建議標準:0.8 <As <1.5。當然,如果裝填工藝穩定,甚至進行了工藝驗證,該模式也可以不進行柱效評價。

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柱效評價的常見問題及處理

前沿峰


可能原因:壓縮過緊。

解決辦法:重新裝填。

拖尾峰

可能原因:1)壓縮過松;2)管路過粗,或檢測器流通池體積過大,造成稀釋效應。

解決辦法:1)重新裝填;2)檢查管路及檢測器流通池規格是否匹配。

低柱效

? ? ? 可能原因:1)沉降不均勻;2)碎填料過多;3)檢測器或泵故障。

? ? ??解決辦法:1)降低勻漿濃度,確保攪拌均勻后一次性緩慢倒入層析柱;2)去除碎填料;3)檢查檢測器及泵是否正常;4)考慮更換為粒徑更細的填料以提高柱效,如TOSOH聚合物基材填料(http://kidkraft.org.cn/brand/view/1.html)。

峰型不佳

? ? ? 可能原因:1)柱床中心凹陷,或柱床與篩網之間存有氣泡,導致樣品流動不均勻(樣品需要繞過凹陷區或氣泡);2)裝填不均勻,甚至內部有裂縫;3)篩網堵塞,導致樣品流動不均勻;4)層析柱無分配器,或分配器設計不佳,導致偏流。

? ? ??解決辦法:1)重新裝柱,優化裝柱策略;2)拆卸、清洗篩網,并確認篩網孔徑是否合適;3)采用具有合理分配器設計的層析柱。

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